胶原肽对2型糖尿病大鼠血清SOD、GSH、MDA及NO表达的影响

朱翠凤^1，3，李艳飞²，彭宏斌³，刘桂琴⁴，陆红1，郭松超²，张帆¹，李勇^3★

（1.北京大学深圳医院，深圳518036；2.广西医科大学公共卫生学院，南宁530021；3.北京大学医学部公共卫生学院，北京100083；4.深圳市福田区中医院，深圳518036）

[摘要]目的:观察深海胶原肽对2型糖尿病大鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）及一氧化氮（NO）表达的影响。方法:选取体重180～220g雄性SD大鼠30只，高脂饲料喂养4周后再小剂量分次腹腔注射链脲佐菌素（STZ）诱导2型糖尿病模型，随机分为糖尿病对照组（A组）、深海胶原肽低剂量干预组（B组，0.75g/kg.d）、深海胶原肽中剂量干预组（C组，1.5g/kg.d）、深海胶原肽高剂量干预组（D组，3.0g/kg.d），每组6只；另外6只为正常对照组（N组）。检测各组喂养6周和10周后的血糖水平，并检测第10周后大鼠血清中SOD、MDA、GSH及NO的变化。结果:一定剂量的深海胶原肽能降低血糖，但差异没有显著性。抗氧化指标结果，与N组比较，各组血清中SOD、GSH显著下降，MDA、NO含量显著上升，差异有显著性（P＜0.01或P＜0.05＝；与A组比较：D组和C组的SOD（P＜0.05＝ 和GSH明显升高（P_C＜0.05,P_D＜0.01＝，MDA（P＜0.05＝和NO明显降低（P_C＜0.05,P_D＜0.01＝；与B组比较：D组的MDA和NO都显著低于B组(P＜0.05＝ ,D组的GSH则显著高于B组(P＜0.01＝。A组与B组，C组和D组之间各项指标虽呈剂量反应的上升或降低，但没有显著性差异（P>0.05）。结论:较高剂量的深海胶原肽(≥1.5g/Kg.d)能有效改善2型糖尿病大鼠的抗氧化应激能力。进一步研究其作用机制，可为深海胶原肽对糖尿病及其心血管并发症的营养干预治疗的临床应用提供新的思路和依据。

关键词：深海胶原肽；超氧化物歧化酶；丙二醛；还原型谷胱甘肽；一氧化氮

作者简介：朱翠凤，女，(1970-)，北京大学博士在读，副主任医师,硕导,北京大学深圳医院营养科主任，研究方向：营养与疾病防治。电话：0755-83923333-3129；E-mail:cf-zhu@263.net。

★通讯作者：李勇，男，（1958-），教授，博导，北京大学公共卫生学院营养与食品卫生系主任，中国营养学会理事、北京市营养学会理事长，研究方向：营养与疾病防治。电话：010-82801177；E-mail:liyong@bjmu.edu.cn。

本研究为国家科技支撑计划资助项目（项目编号：2006BAD27B01）

Effects of Marine Collagen Peptide on serum SOD、MDA、GSH、NO  of type two diabetes  rats

Liu GuiQin¹ , Zhu CuiFeng2,4¹ , Li YanFei ³, Guo SongChao3¹ , Li Yong⁴, et al. (1. Shenzhen City FuTian districtation Chinese Traditional Medical Hospital ;Shenzhen 518036,China)

Abstract: Objective To observe the effect of Marine collagen peptide on serum superoxide dismutase (SOD),malonyldialdehede(MDA), reduced glutathione hormone (GSH), nitricoxide(NO). Methods  6 SD rats were randomly selected as common food control group ;the other 24 SD rats were given hypso-lipoids feedstuff for 4 weeks , and then were given intraperitoneal injection with small dose  STZ to induce type two diabetes , Experimental animals were randomly divided to diabetes control group ,0.75g/kg.d ,1.5 g/kg.d and 3.0g/kg.d Marine collagen peptide group. Blood sugar was detected  after 10 weeks and the changes of SOD,MDA,GSH and NO were detected after 4 weeks in each group. Results   Blood sugar level was decreased by Merine collagen peptide ,but The blood sugar did not change significatively during the experiment . Comparing  with diabetes control group , the level of SOD and MDA increased obviously in 1.5 g/kg.d and 3.0g/kg.d Marine collagen peptide group P＜0.05 or P＜0.01 ,while the level of MDA and NO decreased markedly P＜0.05 or P＜0.01; the antioxygen capability did not change significatively in 0.75g/kg.d dose Marine collagen peptide．Conclusion Marine collagen peptide can improve the antioxygen capability of type two diabetes rats.

Key words : Marine collagen peptide; superoxide dismutase; malonyldialdehede; reduced glutathione hormone; nitricoxide

    全球糖尿病的发病率正在上升。WHO在2000年估计全世界至少有糖尿病病人17700万，每年有400万人左右死于各种糖尿病并发症，照这样发展下去在2025年糖尿病病人至少达到3亿。糖尿病的这种增长主要发生在发展中国家，归因于人口的增长、老龄化、不健康的饮食、肥胖和不参加体育锻炼，90%的糖尿病病例是Ⅱ型糖尿病，并且呈现出明显的年轻化趋势。目前认为，糖尿病的发生机制与胰岛素抵抗和机体高血糖、高血脂等因素诱导的抗氧化应激功能失调有显著的相关性。鉴于糖尿病患者抗氧化应激功能失调与氧自由基反应增强和抗氧自由基酶类活性降低密切相关，本文就具有抗氧化活性和提高免疫力等功效的深海胶原肽对2型糖尿病大鼠血清抗氧化应激指标表达的影响进行实验研究。拟为深海胶原肽对糖尿病及其心血管并发症的营养干预治疗的临床应用提供新的思路和依据。

1  材料与方法

1.1 样品 

      深海胶原肽(符合QB/T2879-2007规定的要求，其中低聚肽≥88% )，由中国食品发酵工业研究院友情赠送。批号：2006／10／26。

1.2 实验动物 

      清洁级雄性SD大鼠35只，体重180~220g，平均210g，由广西医科大学实验动物中心提供。按每笼4只喂养，自由饮水和摄食，室温(20-25)℃，相对湿度(60±5)％，12h/12h昼夜规律。

1.3 2型糖尿病模型制作与分组

      35只健康SD大鼠适应性喂养1~2周，然后随机分出普食正常对照组（N组，n=6只）喂以基础饲料，自由进食。其余29只大鼠喂以高脂饲料（基础饲料中加10％猪油、10％蛋黄粉、1％胆固醇、79％基础饲料）饲养4周，同时自由饮水。4周后，喂高脂饲料大鼠均注射小剂量链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病，按30mg/kg一次腹腔注射1％STZ溶液，临用前用枸椽酸-枸椽酸钠缓冲液配制。N组注入等量容积上述缓冲液。每隔4天一次，共注射3次，72小时后鼠尾取血测定空腹血糖，血糖≥16.7mmol/L的为糖尿病大鼠^[1]。其中只有26只成功制成糖尿病模型，选其中的24只再随机分成4组，每组6只，即糖尿病对照组（A组）、深海胶原肽0.75g/kg.d低剂量干预组（B组）、深海胶原肽1.5g/kg.d中间剂量干预组（C组）、深海胶原肽3.0g/kg.d高剂量干预组（D组）^[2]。深海胶原肽干预组给予不同剂量的深海胶原肽灌胃喂养，正常对照组和糖尿病对照组给予消毒后的自来水作安慰剂灌胃，喂养4周。

1.4 取材和标本制作

      深海胶原肽或安慰剂灌胃4周后，各组大鼠禁食12小时后腹腔注射20％乌拉坦（0.5ml/100g）麻醉，开胸，腹主动脉取血，3500rpm/min离心5min，取血清，分装后-80℃冰箱保存，备用。

1.5 指标测定及方法

1.5.1 血糖测定方法

      6周、10周后，大鼠剪尾取血，采用罗氏快速血糖仪测定空腹血糖。

1.5.2 抗氧化指标的测定

      试剂盒购于南京建成试剂公司。取血清标本，测定大鼠血清中SOD、MDA、GSH、NO水平，按试剂盒说明操作，1cm光径比色杯，波长分别为550、532、412、550处比色，使用722分光光度计测定。

1.6 统计分析

      实验数据以均数±标准差表示，采用SPSS 13.O统计软件，组间比较采用单因素方差分析进行统计分析。

2 结果

2.1 各组大鼠血糖变化

      大鼠于第6周（经高脂饲料喂养4周，再加上注射STZ约2周，即成模后干预前）后，随机选取的24只大鼠均出现多饮、多食、多尿、体重明显减轻的症状，并且血糖明显升高，A、B、C、D组与正常对照组（N 组）相比较差异显著（P＜0.01)，达到糖尿病模型标准。第10周后，糖尿病对照组大鼠（A组）血糖仍处于较高水平，深海胶原肽干预组大鼠的血糖均有所下降，高剂量组（D组）3.0g/kg.d组尤其明显，但与糖尿病对照组（A组）相比较差异无显著性意义（P＞0.05），实验数据如表1所示。

表1 各组大鼠血糖变化（±S）

注：与N组比较，* P＜0.01

2.2  10周后各组大鼠血清中MDA、GSH、NO含量及SOD活性

      10周后（即干预后第4周后），糖尿病对照组(A组)与正常对照组（N组）相比，血清中SOD、GSH显著下降，MDA、NO含量显著上升，差异具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05＝ 。与糖尿病对照组相比较，深海胶原肽高剂量组(D组，3.0g/Kg.d) 的SOD、GSH都明显升高，MDA、NO都明显下降差异都具有统计学意义（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01、P＜0.01＝；深海胶原肽中间剂量组(C组，1.5g/Kg.d) 的SOD、GSH也都明显升高，MDA、NO都明显下降，（P＜0.05、P＜0.05、P＜0.05、P＜0.05＝，差异都具有统计学意义；与深海胶原肽低剂量干预组(B组，0.75g/Kg.d)比较，D组的MDA和NO都显著低于B组(P＜0.05＝，D组的GSH则显著高于B组(P＜0.01) ；C组和D组之间，各指标的变化虽呈剂量反应，但差异无显著性（P＞0.05）；而深海胶原肽低剂量组(B组)大鼠与糖尿病对照组相比，血清GSH和SOD活性略微高于糖尿病对照组比较呈上升趋势，但差异虽无统计学意义（P＞0.05），MDA和NO含量亦有明显的下降趋势，但差异虽无统计学意义（P＞0.05）。实验数据如表2所示。

表2 10周后各组大鼠血清中SOD活性、MDA、GSH、NO含量的变化（±S）

注：与N组比较，* P＜0.05，** P＜0.01；与A组比较，^# P＜0.05, ^## P＜0.01；与B组比较，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01。

3 讨论

      糖尿病及其并发症的发生机制仍没有完全清楚。目前比较公认的看法是，糖尿病并发症的发生与发展主要与胰岛素抵抗，葡萄糖代谢紊乱（葡萄糖毒性作用）和脂肪代谢紊乱（脂肪毒性作用），非酶糖基化终末产物（AGEs）的毒性作用，以及炎症反应和氧化应激等引起的血管内皮功能障碍有关^[3]。

      研究表明：体内过剩的自由基和活性氧的产生及引发的脂质过氧化反应与衰老过程及许多疾病的发生发展密切相关。肥胖、高血糖、游离脂肪酸的过氧化反应以及各种急性炎症刺激等产生的氧自由基等对机体组织的严重伤害，都可以诱发胰岛细胞的损伤、引发胰岛β细胞的凋亡,从而引发糖尿病^[4,5]。帮助体内过氧化物的清除，提高机体的抗氧化和免疫力,有利于慢性疾患的防治，所以天然食物中具有抗氧化、降血糖、降血脂等生物活性物质的临床应用为糖尿病等慢性病及其并发症的防治提供了新的希望。

      深海生物中含有丰富的活性多糖，其具有明显的降血糖功效。^[6]甲壳质是存在于蟹壳、虾皮壳中的一类粘多糖，其主要组成成份是N-乙酰－D-氨基葡萄糖，临床上用于降血脂症和糖尿病的治疗，其机理在于甲壳质能阻止脂肪消化吸收。最近，陈同坡等研究表明壳聚糖使细胞的胰岛素受体敏感性提高，拮抗氧自由基对内皮细胞的损伤。藻酸双酯钠（PSS）是青岛深海大学深海药物与食品研究所研制的褐藻多糖衍生物。刘赛等观察到 PSS对正常大鼠空腹血糖有显著降低作用；刘希江报道应用PSS治疗93例糖尿病，其中Ⅰ型糖尿病19例；Ⅱ型糖尿病74例，前者有效率仅为5.3％，后者达到 73％，因此，认为PSS降血糖机制在于增加胰岛素的敏感性。进一步研究发现PSS维持前列腺素Ⅰ₂和血栓索A₂的平衡，刺激巨噬细胞合成前列腺素Ⅰ₂，降低血小板释放功能，阻止血栓形成，为防治糖尿病提供佐证，因为胰腺组织血管硬化是老年糖尿病的主要致病原因。

      自从1975年Hughes等首先报道从动物组织中发现了具有类吗啡活性的小肽以来，已经从动、植物和微生物中分离出多种多样的生物活性肽。生物活性肽（biologically active peptide或biopeptide）是指对生物机体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物。生物活性肽的结构可以从简单的二肽到较大分子的多肽。它们具有多种多样的生物学功能，如激素作用，免疫调节、抗血栓、抗高血压、降血糖、降胆固醇、抑制细菌、病毒和抗癌作用，抗氧化作用，改善元素吸收和矿物质运输、促进生长、调节食品风味、口味和硬度等^[7,8]。因此，生物活性肽是筛选药物、制备疫苗和功能性食品的天然资源宝库。从深海生物中获得的许多结构新颖、活性独特的生物活性物质将为研制全新结构的新药提供宝贵的“源头”化合物。利用现代生物技术研究生产深海活性多肽已经成为新的研究热点。

      本研究拟通过探讨深海生物活性肽对糖尿病大鼠高血糖、高血脂负荷下抗氧化应激指标表达的影响。为深海新药物资源的开发和深海生物活性肽等功能性食品的临床应用提供线索和依据。深海鱼低聚肽粉 marine fish oligopeptides powder是以深海鱼皮、鱼骨或鱼肉为主要原料，用酶解法生产的、 能被三氯乙酸溶液溶解、相对分子量在1000以下的肽为主要成分的粉末状低聚肽产品。本研究所用的深海胶原肽是以深海鱼皮为主要原料制成的粉末状低聚肽产品。

      本实验中所检测的SOD是超氧阴离子自由基的清除剂，可抑制自由基引起的脂质过氧化反应。氧在代谢过程中可以产生多种性质活泼的自由基，这些自由基使生物膜的多元不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，生成脂质过氧化物(LPO)，LPO可分解产生MDA^[9,10]。SOD活性和MDA的含量是反映机体氧化水平的可靠指标，可以间接的反映胰腺损伤的程度，我们在实验中发现糖尿病对照组大鼠血清SOD较正常对照组显著降低(P<0．01)，血清MDA较正常对照组显著升高(P<0．01)，说明糖尿病对照组大鼠胰腺内氧化应激水平升高，抗氧化能力下降。GSH是一种低分子自由基、过氧化氢和脂质过氧化物清除剂，是细胞内最重要的清除毒物的内源性物质，若体内自由由基过多可使GSH耗竭。NO是一种难溶于水的脂溶性气体，其分子结构中含有不配对电子，是一种自由基。它可以与氧自由基相互作用生成具有更强毒性的过氧亚硝酸自由基(．OONO^-)，促进脂质过氧化反应而加速疾病的进程^[11]。有证据表明，氮氧自由基可作为细胞因子诱发β细胞破坏的中介者^[12]。所以，测定GSH的含量和NO的水平，也可间接反应糖尿病大鼠机体器官功能的损伤程度，本实验结果中糖尿病对照组大鼠血清GSH较正常对照组明显降低，NO水平明显升高。干预组的糖尿病大鼠较对照组的糖尿病大鼠的各项指标都在一定程度上有所改善，血清中的SOD含量和GSH含量明显升高，MDA和NO水平明显降低，因此认为深海胶原肽可以升高血清中的SOD、GSH含量，且可以降低血清中的MDA、NO水平，本实验还发现，深海胶原肽高、中、低剂量三种治疗虽均能提高糖尿病大鼠的抗氧化能力，但低剂量组远不如中、高剂量组，且与糖尿病对照组大鼠比较无显著性意义。

      综上所述，深海胶原肽对2型糖尿病的血糖水平的影响还有待加大样本量和进一步的研究证实；较高剂量的深海胶原肽可以改善2型糖尿病大鼠的抗氧化能力。对深海胶原肽对糖尿病抗氧化功效的深入研究可为临床应用深海胶原肽防治糖尿病及其心血管并发症提供思路和依据。有关深海胶原肽防治糖尿病并发症的疗效、作用机理的进一步资料有待更深入的体内实验获得和验证。

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